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Falck-Hillarp甲醛诱发荧光法

Falck-Hillarp甲醛诱发荧光法

 

    去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、5―羟色胺、组胺等生物单胺类物质在组织内的含量甚微,需用高敏感性的技术方法才能在细胞水平显示。生物胺荧光组织化学是在诱发荧光的基础上建立的一种特异性强、敏感性高的技术方法。常用醛类诱发生物胺荧光的方法有Falck-Hillarp甲醛诱发荧光法、乙醛酸诱发生物单胺类荧光以及邻苯二醛诱发组织胺荧光法。

 

    该法主要用于显示儿茶酚胺(catecholamine,CA),如去甲肾上腺素、多巴胺及5―羟色胺等

    1.原理  甲醛与儿茶酚胺等生物胺冰冻干燥后,先经过闭环作用,再经脱氧反应,形成3,4―二氢异喹啉,在适当pH下,后者成为互变异构醌型结构而产生强荧光,其最大激发波长和最大发射波长分别为410nm和480nm。

 

    2.组织标本制备

    (1)铺片:对于富含交感神经支配的去甲肾上腺素能纤维的虹膜、肠系膜和皮下结缔组织等可以制备铺片。以虹膜为例,其铺片过程如下:取出眼球,在解剖显微镜下尽量除去周围结缔组织,用虹膜剪沿眼球前部环形剪开,剔除晶状体,将角膜向下置于清洁的载玻片上,再用钟表镊将虹膜从睫状体撕下,将其在清洁的载玻片上铺展成虹膜原本的形状,用滤纸将周边液体吸干后,置于含P2O5的真空干燥器内过夜。其他组织亦可采用同样方法制作铺片。

    (2)脑组织涂片:将小块脑组织置于清洁载玻片上,用另外的载玻片呈锐角推过该脑组织,制作均匀的脑涂片,方法类似制作细胞涂片,干燥同前。脑涂片的组织结构虽较紊乱,但可通过荧光膨体测量儿茶酚胺含量,作为药理学干预或损伤的一种快速普查法。

    (3)冰冻干燥法:取脑组织(1.0cm×0.5cm×0.5cm)置于OCT包埋剂内(可按切片需要调整组织块方向),用液氮速冻,然后进行冷冻干燥,组织块亦可在液氮中保存。已干燥的组织块置P2O5的干燥器内再继续干燥数天。

 

    3.甲醛处理  将已干燥的组织标本与含5g多聚甲醛的小器皿一同置入80%的烘箱内l―3小时,肾上腺素的反应较慢,需3小时左右,而后移至暗处,逐渐恢复至室温(一般为25%)后,水溶性封片剂封片,荧光显微镜观察。

 

    4.结果  儿茶酚胺中多巴胺、去甲肾上腺素神经元为黄绿色荧光,轴突前末梢较细胞体和膨体更易显示;5-羟色胺神经元为黄色荧光。

 

    5.注意事项

    (1)多聚甲醛试剂含水量的多少对结果影响较明显,含水量太少,所诱发的荧光弱,则显示含单胺结构少,而含水量多时.荧光物质会发生弥散,所以,实验前最好先将多聚甲醛经含水量恒定处理,即将一定量(如50g)的多聚甲醛置于适当大小的培养皿内与500ml硫酸(相对湿度为70%左右)共同置于干燥器中,盖好干燥器盖,室温下放置7―10天。

    (2)如显示5―羟色胺神经元,最好用单胺氧化酶抑制剂(如帕吉林,pargyline)预处理,再经5―羟色胺前体孵育,将有利于5―羟色胺神经元的显示。

来源:百度学术

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