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大鼠乳鼠成骨细胞培养实验

      大鼠乳鼠成骨细胞培养培养可以:(1)获得大鼠乳鼠成骨细胞;(2)用于骨修复的细胞学机制研究。


实验方法原理

       取材于出生2~3 d 小鼠颅骨,以含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养,采用胶原酶消化法分离成骨细胞,并进行细胞接种与传代。采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法。


实验材料

      SD大鼠


试剂、试剂盒

      F12 完全培养液   胰蛋白酶   Ⅱ型胶原酶   酒精


仪器、耗材

       手术器械   磁力搅拌器

 

 

                                                    此文转载:丁香通



实验步骤

一、实验步骤


      1.  拉颈处死24 小时内新生的SD大鼠,75%乙醇浸泡5 min,取出头盖骨,分离顶骨和额骨,冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血,放入另一盛有F12 完全培基液的培养皿中再洗涤, 将颅骨剪成2~5 mm碎片,将洗涤过的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 预消化15 min,以清除纤维组织细胞,弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。

      2.  然后以0.1%  Ⅱ型胶原酶10 ml,在37℃环境中消化 20 分钟,室温下磁力搅拌消化20 分钟。静置数分钟,收集消化液,室温下以1200 rpm离心10 分钟。去除上清液,用20% 胎牛血清的F12 培养液4 ml 悬 浮细胞,接种于75 ml 培养瓶中,补培养液8 ml 使每瓶液体量达到12 ml;对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20 分钟、磁力搅拌消化15 分钟、离心10 分钟,将获得的3 瓶细胞放置于二氧化碳培养箱,在5% CO2,95%空气,37℃温度下培养,24 小时后可见细胞贴壁生长,胞质开始伸展,换新鲜培养液,以后每隔48 小时换培养液(注:消化视具体情况而定,也可多消化 1 遍)。

      3.  原代培养一般接种后第7 天能长满。传代时,取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞 1 瓶,弃去培养 液,传代时先以 PBS 冲洗 2 遍,加 0.25%胰酶1 ml,室温下消化3~5 分钟,将胰蛋白酶液弃去,加 F12 培养液充分吹打8-10 分钟。将已消化的细胞收集、合并,计数;用 F12 完全培基调节至细胞浓度为合适浓 度。一般取2-5 代成骨细胞进行实验。代数太多,细胞老化或者分化明显。
 
二、结果
      如图所示,成骨细胞的形状和成纤维细胞非常相似,但是不同的是,比成纤维细胞更不容易消化,尤 其是传代次数多,细胞老化的时候,非常难消化,并且不易消化成单个细胞。
 
图1:成骨细胞
图2:成骨细胞100倍
 

图3:成骨细胞形成的矿化结节

三、鉴定的方法
      1.  碱性磷酸酶(ALP)活性检测
      2.  骨玻璃样蛋白(BGP)检测

      3.  矿化结节检测



其他


一、讨论

      成骨细胞包绕在硬组织中,致使处理困难,可采用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织块法、 骨髓培养法以及薄层骨片经 EDTA 处理并经胶原酶消化,均可培养出成骨细胞。体外培养的成骨细胞保持 有骨组织细胞的某些特征。据文献报道,不同方法培养的成骨细胞形态是不同的[1]
 
二、文献

      [1]  司徒镇强. 细胞培养 [M]. 第一版. 西安. 世界图书出版社西安公司, 2000:115.


此文转载来源:丁香通



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