一、免疫组化的意义

随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，部分病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可。

二、免疫组化原理

免疫组化利用抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

三、免疫组化的步骤

1、将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。

2 、PBS清洗标本3次各2 min。

3 、4%的多聚甲醛固定15分钟；【冷甲醇：丙酮1：1】

4、空气干燥5min。

5、PBS清洗标本3次各2 min。

6 、0.5%Triton X-100( DPBS配)孵育1次20 min。

7 、PBS清洗标本3次各2 min。

8、3%H2O2孵育15 min。

9、PBS清洗标本3次各2 min。

10、封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。

11、一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC过夜或37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液。

12 、PBS清洗标本3次各5 min。

13、二抗工作液孵育pv6001（湿盒）37OC 30 min。

14 、PBS清洗标本5次各2 min。

15、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约10~15min。

16、蒸馏水或自来水洗1次5 min。（可放六孔板内，再将孔板放在饭盒等内，自来水下冲洗）

17、苏木素复染10min。

18、自来水洗5min。

19、树胶封片。

四、免疫组化注意事项

1、苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。

2、DAB显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。

3、抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度过夜。

4、切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。

此文转载：丁香通