一、cDNA文库构建的意义

    cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

二、cDNA文库构建的原理

    cDNA文库也叫部分基因文库，它是以mRNA为模板,由逆转录酶催化形成的互补DNA(cDNA),其核苷酸序列完全互补于模板mRNA链;再以cDNA为模板,由DNA聚合酶合成第二链,得到互补双链DNA.由于模板mRNA含有该种细胞的各种mRNA分子,因而合成的cDNA产物是各种mRNA拷贝的混合物,然后将双链产物与载体(质粒或噬菌体)DNA重组,并转化到宿主细菌或包装成噬菌体颗粒,得到一系列重组的克隆混合体.每个克隆含单独一种mRNA分子,克隆总和则包含细胞的全部mRNA信息,即cDNA文库赞同。

三、cDNA文库构建的步骤

    阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 

    阶段2：cDNA第二链的合成 _1 

    阶段3：cDNA的甲基化 

    阶段4：接头或衔接子的连接 

    阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 

    阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接

四、cDNA文库构建的的关键

    反转录成功与否及反转录效率是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。有研究者基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。

此文转载：丁香通