真菌总 RNA 的制备

试剂、试剂盒

         氯仿   异戊醇 12mol L 氯化锂   3mol L 乙酸钠   乙醇   DEPC 处理的水


仪器、耗材

      水浴   低温高速离心机


实验步骤

一 材料与设备

      1) 酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)。

      2) 氯仿:异戊醇 (2:1)

      3)12mol/L 氯化锂。

      4)3mol/L 乙酸钠。

      5)70% 乙醇。

      6)DEPC 处理的水

      7) 水浴。

      8) 低温高速离心机。


二 操作方法

      1) 在装有液氮的研钵中研磨 2〜5 g 真菌组织,直至完全变成粉末。

      2) 把研磨好的粉末转移到 Falcon 管中,管中装有提取缓冲液 (每克真菌用 3 mL 提取缓冲液)及等体积酚:氯仿:异戊醇 (预热到 65℃)

      3) 振摇试管以彻底混合。

      4) 把混合物转移到一个无 RNase 的离心管中,以 13000〜18000 g 于 4℃ 离心30 min

      5) 收集上层水相,加入等体积的氯仿:异戊醇 (24:1),翻转混匀。

      6) 以 1300〜18000 g 于 4°C 离心 30 min。

      7) 收集上层水相,加入 12mol/L 氯化锂至终浓度髙于 2mol/L。

      8) 混合后于 4℃ 过夜以沉淀 RNA,

      9) 以 13000〜18000 g 于 4℃ 离心 30 min

      10) 去上淸,以 5 ml3mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 清洗沉淀,按第 9) 步离心 15 min

      11) 去上清. 以 20 ml70% 乙醇清洗沉淀,再按第 9) 步离心 I5 min。

      12) 用 70% 乙醇重复冼涤一次。

      13) 真空干燥以去除乙醇,

      14) 以适当体积(250〜lOOOul)DEPC 处理的水溶解沉淀。

      15) 溶解的 RNA 于-70°C 保存。


注意事项

      1) 将研磨好的真菌转移到 Falcon 管中时,要小心操作以避免损失. 所有操作都应该迅速,样品/试管尽暈放在冰上以降低 RMase 的作用。

      2)65℃ 加热可帮助 RNA 溶解。如果有不溶颗粒,可于 13000〜18000 g 离心 2 min, 收集上清,沉淀中部分或极少含有 RNA 或不含RNA.


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