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mRNA的S1作图实验

实验材料

      mRNA


试剂、试剂盒

      琼脂糖   电泳缓冲液   ATP   寡聚核苷酸引物   多核苷酸激酶缓冲液   T4


仪器、耗材

      离心机   分光光度计   摇床


实验步骤

一、图片简介
 


二、实验步骤
 

      1.  用1×碱性制胶缓冲液制备1.2%的低融点琼脂糖,并将凝固好的胶在1×碱性电泳缓冲液中浸泡过夜。
      2.  将以下试剂混合以制备磷酰化的寡聚核苷酸:

      (1)20 μl   [γ-32P]ATP(10 mCi/ml,共200 μCi)

      (2)1 μl  100 μg/ml 寡聚核苷酸引物
      (3)25 μl  10×多核苷酸激酶缓冲液
      (4)4 U  T4多核苷酸激酶
      (5)30℃反应30 min 后,65℃加热5 min 灭火激酶。
      3.  将溶于55 μl 水的18 μg 单链模板DNA和9 μl 10×TM缓冲液加入已磷酸化的寡聚核苷酸中,40℃杂交15 min。
      4.  加入9 μl 4 mmol/l dNTP混合液和2 μl klenow酶,37℃保温30 min 以延伸寡核苷酸模板,65℃加热5 min 灭活klenow酶后置于冰浴。
      5.  加入10 μl 10×限制酶缓冲液和40 U 限制性内切酶,37℃保温45 min 切割探针,65℃加热5 min 灭活限制酶。
      6.  加入100 μl 5mol/l 乙酸铵和500 μl 乙醇,-20℃沉淀过夜或干冰/乙醇中放置15 min,在微量离心机中离心15 min,晾干沉淀。
      7.  将沉淀物重溶于25 μl 碱性加样缓冲液。加样并在最大电压降为1.8 V/cm 下电泳4 h。
      8.  疑胶用X光感光片曝光5 min,冲洗感光片,对比凝胶和感光片,切下探针所在处的凝胶。
      9.  将切下的凝胶移入一个微量离心管中,65℃融化,确定体积后,加入等体积的TE缓冲液,再在65℃保温10 min。

      10.  加入1 μl 10 mg/ml tRNA和缓冲液平衡酚抽提2次后(不要用酚/氯仿),加入0.1体积的3 mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液及2倍体积无水乙醇沉淀。

      11.  沉淀用100 μl 0.3 mol/l乙酸钠重溶,取1 μl 进行切伦科夫计数。

      12.  在不多于50 μg RNA中加入5×104切伦科夫计数的探针,调整最终体枳为100 μl,盐浓度为0.3 mol/l 乙酸钠,加入250 μl 乙醇沉淀。


      13.  以70%乙醇/30%DEPC处理过的水冲冼,并倒扣在Kimwipes纸上晾干30 min。
      14.  重溶沉淀于20 μl S1杂交液,65℃变性10 min,30%杂交过夜。
      15.  每个反应中加入以下S1核酸酶反应混合物: 
      (1)150 μl  2×S1核算酶缓冲液
      (2)3 μl  2 mg/ml单链小牛胸腺DNA
      (3)147 μl  水
      (4)300 U  S1核酸酶
      (5)60℃反应30 min,加80 μl S1终止缓冲液以终止反应。
      16.  加1 ml 无水乙醇,沉淀。以70%乙醇冼沉淀,在Speedvac蒸发器中干燥5 min。
      17.  重溶于3 μl TE缓冲液和4 μl 甲酰胺加样缓冲液,煮沸3 min后,置于冰上。
      18. 按下面的提示制备合适浓度的聚丙烯酰胺/尿素凝胶。
 
 
      19.  在凝胶上加样3~5 μl 进行分析,凝胶放射自显影后确定标记DNA片段的大小。

此文转载来源:丁香通


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