核转录 (runoff) 分析可以用于检测分离细胞核中特定基因的转录效率。进行核转录失控分析时，在体外将细胞核分离出来，然后在放射性同位素标记的核苷酸存在下进行转录，所合成的 KNA 均因掺入同位素而被标记，此混合 RNA 与固定在硝酸纤维素滤膜 h 的某一特定甚因的 DNA 探针杂交，就可以反映出该基因的转录狀态和转录速率。

实验材料

      cDNA   0.45um 硝酸纤维素 尼龙膜   酵母 tRNA

试剂、试剂盒

       PBS   NP-40 裂解缓：   20XSSC   LNaOH   甘油储存缓冲液   10X 转录缓冲液   核苷酸:ATP   GTP   CTP   200uCi「α32P]-UTP   10XSET   蛋占酶 K   无 RNase 的 DNase   CaCI2   硫氰酸胍溶液   Tris-SDS 缓冲液   水饱和酚氯仿   异戊醇   无水乙醇   异丙醇   乙酸钠

仪器、耗材

      紫外交联仪 D   狭缝印迹装   杂交箱

实验步骤

一材料与设备

      1)cDNA

      2)PBS

      3)NP-40 裂解缓：0.5%NP-40,10mmol/LTris-HCl(pH7.4)，3 mmol/LMgCl₂,10 mmol/LNaCl

      4)20XSSC:3mol/LNaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠 (pH7)。

      5)1mol/LNaOH

      6) 甘油储存缓冲液：40% 甘油，50 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 0.5 mmol/L MgCl₂, 0.lmmol/L EDTA

      7)10X 转录缓冲液：l00 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，50 mmoI/LMgCl₂，800 mmol/LKCllmmol/LEDTA,5 mmol/LDTT

      8) 核苷酸:ATP,GTP，CTP

      9)200uCi「α³²P]-UTP:3000Ci/nmol。

      10)10XSET;5%SDS，50 mmol/LEDTA，50 mmol/LTris-HCl(pH7,4)

      11) 蛋占酶 K

      12) 无 RNase 的 DNase:1Omg/mL

      13)CaCI₂：20 mmol/L

      14) 硫氰酸胍溶液:4mol/L 硫氰酸胍，25 mmol/h 柠檬酸钠 (PH7.0),0.5%Sa    rcosyl0.lmol/L2-疏基乙醇

      15)Tris-SDS 缓冲液：Tris-HCl(PH7.2),1 mmol/LEDTA,0.1%SDS

      16) 水饱和酚

      17) 氯仿：异戊醇 (49:1)

      18)0.45um 硝酸纤维素/尼龙膜，

      19) 无水乙醇。

      20) 异丙醇。

      21) 酵母 tRNA:10 mg/ml。

      22) 乙酸钠：2mol/L

      23) 紫外交联仪 D

      24) 狭缝印迹装

      25) 杂交箱。


二、操作方法


下面每一步均在 0-4°C 进行

      1）用冷的 PBS 洗 1X10⁷-5X10⁷ 个细胞，1500 g 离心 5 min 收集细胞。

      2) 去除上清，重悬细胞于 PBS 中，1500 g 离心 5 min 收集细胞。

      3) 去除上清，加入 4 mlNP-40 裂解液，温和涡漩振荡, 冰上放置 10 min

      4) 于 4℃,400 g 离心 10 min 沉淀细胞核。用 NP-40 裂解液洗涤一次.

      5) 用 200ul 甘油缓冲液重悬沉淀，在显微镜下观察细胞裂解情况。

      6) 分装，冻存于液氮中。

(二）核转录

      1) 在无菌离心管中加入：3X107 个细胞核，35% 甘油，20ul1OX 转录缓冲液，4 mmol/LATP，GTP，CTP,200uCi(α³²P]-UTP, 加蒸馏水至 200ul 于 26°C 温育 10 min

      2) 加入 10ul_DNase1，10ul20 mmol/LCaCl₂，于 26℃ 温育 lOmin，酶切核 DNA。

      3) 加入 2ul 蛋白酶 K,25ul10×SET,5ul 酵母 tRNA，于 37℃ 温育 30 min。

      4) 加入 550ul 硫氰酸胍溶液，90ul2mol/LNaAc，900ull 水饱和酚，180ul 氯仿/异戊醇，置于冰上 15 min。

      5) 于 4℃,12000 g 离心 15 mm, 吸出水相。

      6) 加入等体积异丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h。

      7) 于 4℃12000 g 离心 15mim 用 300ul  硫氰酸胍溶液溶解沉淀，

      8) 加入等体积异丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h,

      9) 与 4℃12OOOg 离心 15mim, 用 70% 乙醇洗涤沉淀，用 1 mlTris-SDS 缓冲液溶解沉淀。总活性为 1X10⁷-2X10⁷cpm。

(三) 杂交分析

      1) 在 100ul 的 25ug cDNA 探针或 50ug 线性质粒中加入 10% 体积的 lmol/LNaOH，使之变性。

      2) 温育 15 min, 用 10 倍体积 6XSSC 中和。

      3) 剪裁大小合适的硝酸纤维素/尼龙膜。用 0.4mol/LTris(PH7.0) 溶液将膜浸泡30 min, 而后将膜置于狭缝印迹装置上。

      4) 将 1-5ug DNA 加至膜上，真空状态下于 80℃ 烘烤 2 h 或紫外交联 2 min。

      5) 按常规方法进行预杂交，杂交。

      6)X 射线片，显影分析。

注意事项

      1) 洗膜的时间可根据实验确定. 上要考虑使用的探针的性质和力求莸得最小背景。

      2) 细胞核的质量是核失控转录测定的关键。Dounce 匀浆器有助于制备不易被 NP40 裂解的细胞的核。

此文转载来源：丁香通